Эштон родился в городе Олбани штата Нью-Йорк 17 февраля 1978 года. В детстве его впечатлил персонаж Люк Скайуокер из фильма «Звездные войны» настолько, что мальчик принял решение стать актером. Он брал уроки актерского мастерства и принимал участие в школьных постановках, Эштон Холмс также пел в группе Method of Groove.
После школы Эштона Холмса взяли в театральную труппу, с которой он играл в спектакле «Рента» на площадках по всем Соединенным Штатам. Он также выступал в постановках «Снежная королева» и «Рождественская песня». В 2002 году начинающий актер впервые появился на телевизионных экранах с ролью Грега в мыльной опере «Одна жизнь, чтобы жить», которая выходит на канале ABC с 1968 года. В 2005 году Эштона взяли на роль Джека Столла, сына-подростка главной героини, в криминальном триллере «Оправданная жестокость».
Холмса также можно увидеть в сериалах «Закон и порядок: специальный корпус», «Детектив Раш» и «Говорящая с призраками». В 2006 году актер сыграл Скотта Литтла в нескольких эпизодах сериала «Юристы Бостона». В этом же году Эштон снялся в роли Томми в драматическом фильме «Мирный воин».
В биографическом фильме под названием «То, что мы делаем - тайна» о музыканте Дарби Краше, основателе панк-рок группы Germs, Холмс сыграл Роба Хенли, гомосексуального партнера главного героя. Одна из главных ролей Эштону Холмсу досталась в драме «Подростки как подростки» 2007 года режиссера Бета Шактера. 27 апреля того же года состоялась премьера фильма ужасов «Призраки», в котором актер получил главную мужскую роль. Вместе с Деннисом Куэйдом, Сарой Джессикой Паркер и Томасом Хейден Черчем Холмс появился в комедийной драме «Умники», которая была представлена на Кинофестивале «Сандэнс» в 2008 году.
Среди недавних работ актера – роли в фильмах «Тихий Океан» 2010 года, «Разделитель» 2011 года, а также сериалах «CSI: Место преступления», «Никита» и «Обмани меня».
