С детства движимый желанием сниматься в кино, после окончания школы он начал учиться в Ленинградском институте театра, музыки и кинематографа, диплом которого получил в 1973 году. Сразу после этого он начал работать на киностудии «Ленфильм». Первые роли были ещё в студенчестве, так в 1972 году зрители увидели картину «Включите северное сияние» Р. Василевского. Позднее были фильмы «Докер», «Фронт без флангов», «Сибириада» и некоторые другие. Но визитной карточкой Евгения Борисовича стала совсем небольшая эпизодическая роль в известной во все времена ленте «Место встречи изменить нельзя». Его Вася Векшин получился настолько ярким и запоминающимся, что даже в наши дни актёр у многих ассоциируется только с ним. Немалую помощь в создании этого образа оказал Владимир Высоцкий, который знал о послевоенных годах не понаслышке.
После этой звёздной роли Леонов-Гладышев ещё много снимался, чаще всего его приглашали на роли военных. Вскоре это однообразие наскучило артисту, и он решил попробовать себя в чём-то новом. В начале девяностых состоялся его дебют в режиссуре, совместно с Виктором Трахтенбергом он снял драму «Высшая мера», правда, широкая публика так и не увидела эту картину.
В наши дни Евгений Леонов-Гладышев периодически снимается в сериалах. Зрителя очень порадовал образ майора Шишкина, созданного артистом в сериале «Убойная сила». Также он успевает заниматься режиссурой (в 2000 году вышел сериал «Дом надежды» о деятельности брачного агентства) и общественной деятельностью (он является президентом Гильдии актёров кино города Санкт-Петербурга). Во всём этом ему помогает его вторая жена Татьяна.
