Джулианна Луиза родилась 8 июня 1966 года в Нью-Йорке в семье потомков еврейских иммигрантов из Восточной Европы. Она стала третьей дочерью балерины и хореографа Франчески Маргулис и копирайтера Пола Маргулиса. В детстве малышке приходилось часто разъезжать по разным странам, так как семья постоянно переезжала с места на место. Маленькая Джулианна росла во Франции, Англии, Америке. Окончив среднюю школу, девушка решила получить актерское образование — Джулианна постигала азы драматического искусства в нью-йоркской актерской студии. В кино начала сниматься с 25 лет. Маргулис дебютировала эпизодической ролью проститутки в боевике со Стивеном Сигалом в главной роли «Во имя справедливости» (1991). Следующие пару лет актриса появлялась в различных телесериалах в небольших ролях. В 1994-м году в карьере 28-летней Джулианны Маргулис случился настоящий прорыв — девушка прошла кастинг в телесериал о жизни медиков «Скорая помощь» (1994 — 2009). Актрисе досталась одна из ведущих ролей — медсестры Кэрол. Проект, рассказывающий о жизни приемного отделения больницы Чикаго, сотрудников и пациентов, оказался невероятно успешным. В течение 15 сезонов подряд он находился в рейтинге самых просматриваемых сериалов Америки, ежегодно удостаивался премий «Эмми» и «Золотой глобус». Он стал самой длинной медицинской драмой в истории американского ТВ, которую показывали в прайм-тайм. Проект мгновенно прославил практически весь актерский состав — в том числе и доселе никому не известную Джулианну, которая также удостоилась неоднократных номинаций на «Эмми» и «Золотой глобус».
Одновременно актриса находила время и для участия в других проектах. В 1997-ом Джулианна появилась в трех картинах — красотки Джеан в мелодраме об авантюрах одного мошенника «Путешественник», пленницу японского гарнизона в военной драме «Дорога в рай», и Рейчел в драме об отношениях «Дороже рубинов» с Рене Зеллвегер в главной роли. Впрочем, по-настоящему крупные роли актрисе удалось сыграть только после того, как в 2000-ом году, после 6-летней игры, она покинула проект «Скорая помощь», уже в статусе телезвезды.
Следом она сыграла разноплановые главные роли — наследницу верховной жрицы в борьбе за престол в фантастике «Туманы Авалона» (2001), невесту Сару, которая накануне свадьбы переживает настоящий переполох, в комедии «Большой день» (2001), роковую красавицу Дену в эротической драме «Побег с «Елисейских полей» (2001), Бернадетт Битти в ирландской драме «Эвелин» (2002) об отце, который боролся за право общаться с детьми после ухода жены и потери работы, компаньонку капитана, которая отправляется на поиски таинственного судна в фантастическом триллере «Корабль-призрак» (2002).
В 2007-ом Джулианна вышла замуж за юриста Кита Либертала. 17 июля 2008 года 42-летняя актриса впервые стала мамой, родив сына.
Несмотря на большое количество работ актрисы в полнометражном кино, вторую волну популярности ей вновь принес телесериал. В 2009-ом молодая мама стала главной героиней драмы «Правильная жена». Джулианна сыграла жену и мать, чей супруг оказывается в тюрьме, да еще и в центре грандиозного сексуального скандала. На плечи женщины сваливаются заботы о семье, и в каждой серии героиня Маргулис с достоинством выходит из неоднозначных ситуаций. Актерская работа в этом проекте вновь принесла Джулианне победу на «Эмми» и «Золотом глобусе».
