Джон родился 22 июля 1964-го года в столице Колумбии, городе Богота. Его родителями были Альберто и Лаз Легуизамо. По словам актера, его дед по отцовской линии имел смешанное пуэрториканско-итальянское происхождение, тогда как предки по материнской линии были ливанцами. Отец Джона был начинающим кинорежиссером. В студенческие годы он учился на всемирно известной итальянской киностудии «Чинечитта», но завершить образование не удалось по причине отсутствия финансов на его оплату. Когда маленькому Джону исполнилось четыре года, вся семья переселилась в Соединенные Штаты. Они обосновались в Нью-Йорке, где меняли место жительства несколько раз, но переезжали исключительно в пределах Куинса, живя то в одной, то в другой его части. Одним из мест их проживания был дом в Джексон-Хайтсе, где селилась этническая латиноамериканская община. Впоследствии сам Легуизамо шутил на эту тему, говоря, что проживание в Джексон-Хайтсе внесло большой вклад в его будущую актерскую карьеру. Ситуация в районе была довольно криминальной. Будучи подростком Джон не мог просто пройти через парк и при этом не быть кем-либо атакованным. Приходилось что-то придумывать, чтобы хоть как-то уберечь себя. Так ему впервые пришла в голову мысль, что неплохо бы быть смешным в глазах окружающих. Это стало основой будущего комедийного амплуа в актерской карьере Легуизамо. Сначала Джон был учеником средней школы Joseph Pulitzer Middle School. Позднее он поступил в Murry Bergtraum High School, где написал первый комедийный сценарий, который протестировал на одноклассниках. Уже тогда сверстники признали будущего актера самым болтливым учеником в школе. Сразу после окончания средней школы Легуизамо поступил в нью-йоркскую школу искусств Tisch School of the Arts, где приступил к изучению актерского мастерства. К концу обучения он уже имел твердую уверенность, что его призвание это стендап камеди. После этого Джон стал студентом университета Long Island University C.W. Post Campus, где также брал уроки драматического искусства. В начале 80-х Легуизамо дебютировал в качестве стендап комика на сцене одного из нью-йоркских ночных клубов. В 1984-м году Джон впервые принял участие в съемках. Его дебютом стала небольшая роль в культовом телесериале «Полиция Майами: Отдел нравов». Затем он появился в видеоклипе Мадонны на ее композицию «Borderline». Далее последовала череда киноролей: «Военные потери», «Крепкий орешек 2» и «Кое-что о Генри». Первой крупной работой Джона в кино стала главная роль в фильме, основанном на видеоигре «Супербратья Марио». За все время Легуизамо уже исполнил более девяти десятков ролей в кинематографе, принял участие в озвучивании нескольких компьютерных игр, написал автобиографию. Сейчас актер продолжает принимать активное участие в разнообразных театральных постановках.
