Мастроянни вырос в Турине, куда переехала его семья вскоре после его рождения. Семья будущего актёра жила бедно, поэтому с юных лет ему приходилось подрабатывать. В юности, проявилась страсть Марчелло к сцене: он принимал участие во всех школьных спектаклях.
После школы Мастроянни пошёл в ремесленное училище. Он вполне мог бы стать архитектором или инженером, но в дело вмешался случай: Марчелло попал в массовку картины «Marionette» («Марионетки»). С тех пор он начал активно сниматься в кино, довольствуясь в основном мелкими и незначительными ролями. Но в возрасте двадцати пяти лет ему начали предлагать более весомые партии. Так он принял участие в таких картинах, как «Cuori sul mare» («Сердца над морем»), «Vita da cani» («Собачья жизнь») и «Domenica d'agosto» («Августовское воскресенье»).
Марчелло Мастроянни начал продвигаться к вершине актёрского олимпа. В 1957 году он снялся в мелодраме Лукино Висконти «Le notti bianche» («Белые ночи»). Эта роль принесла Мастроянни настоящую славу и признание. Следующей знаковой работой артиста стал блестяще сыгранный образ Тиберио в авантюрной комедии Марио Моничелли «I soliti ignoti» («Злоумышленники, как всегда, остались неизвестны»).
Но пик кинокарьеры итальянского артиста пришёлся на шестидесятые годы, когда он начал принимать участие в фильмах легендарного режиссёра Федерико Феллини и не менее значимого для мирового кинематографа Микеланджело Антониони.
Среди самых известных картин Феллини с участием Мастроянни стоит отметить следующие: «La dolce vita» («Сладкая жизнь») и «8½» («Восемь с половиной»). А у Микеланджело Антониони артист снялся в знаменитой драме «La notte» («Ночь»).
Позднее фильмография актёра пополнилась работами в таких картинах, как «La grande bouffe» («Большая жратва»), «Matrimonio all'italiana» («Брак по-итальянски») и «Очи чёрные». Режиссёром последнего фильма является Никита Михалков.
Марчелло Мастроянни скончался в Пари же 19 декабря 1996 года от рака поджелудочной железы.